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激光共聚焦顯微鏡的校準(zhǔn)是確保成像質(zhì)量和精度的關(guān)鍵步驟。以下是幾種常見(jiàn)的校準(zhǔn)方法：
1. 掃描畸變校正
掃描畸變是激光共聚焦顯微鏡常見(jiàn)的問(wèn)題，通常由掃描系統(tǒng)中的機(jī)械誤差引起。一種有效的校準(zhǔn)方法是采用標(biāo)準(zhǔn)光柵試件進(jìn)行全場(chǎng)校正。具體步驟如下：
根據(jù)光柵樣品的柵距和掃描線數(shù)計(jì)算掃描區(qū)域的大小。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)光柵樣品進(jìn)行掃描，形成掃描云紋圖像。
通過(guò)移動(dòng)樣品臺(tái)使光柵樣品發(fā)生特定位移，記錄不同相移量下的云紋圖像。
利用云紋相移技術(shù)計(jì)算出相位圖，并解包裹得到原始相位圖。
根據(jù)相位函數(shù)計(jì)算出掃描畸變場(chǎng)，從而實(shí)現(xiàn)校正。
這種方法具有精度高、操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)測(cè)量且可進(jìn)行全場(chǎng)測(cè)試等優(yōu)點(diǎn)。
2. STED系統(tǒng)校準(zhǔn)
對(duì)于配備STED（受激發(fā)射損耗）功能的激光共聚焦顯微鏡，校準(zhǔn)是確保超高分辨率成像的關(guān)鍵。STED系統(tǒng)每次開(kāi)機(jī)后需要進(jìn)行校準(zhǔn)：
將物鏡切換到100倍，并確保STED激光和至少一條普通激光開(kāi)啟。
在軟件中點(diǎn)擊“Align Beams”按鈕，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)行校準(zhǔn)。
校準(zhǔn)完成后，軟件會(huì)顯示“Alignment successful!”。如果校準(zhǔn)失敗，可以調(diào)用預(yù)設(shè)的校準(zhǔn)設(shè)置重新進(jìn)行校準(zhǔn)。
3. 光學(xué)參數(shù)校準(zhǔn)
光學(xué)參數(shù)的校準(zhǔn)包括激光強(qiáng)度、針孔大小、探測(cè)器靈敏度等。這些參數(shù)需要根據(jù)樣品的熒光特性進(jìn)行調(diào)整：
激光強(qiáng)度：根據(jù)樣品的熒光強(qiáng)度調(diào)整激光功率，以避免光漂白和光毒性。
針孔大小：調(diào)整針孔直徑以平衡圖像的分辨率和亮度。
探測(cè)器靈敏度：根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整探測(cè)器的增益，以提高信噪比。
4. 數(shù)字圖像處理校正
對(duì)于微小的配準(zhǔn)誤差，可以使用數(shù)字圖像處理方法進(jìn)行校正。大多數(shù)激光共聚焦顯微鏡的軟件都具備這種功能，可以在圖像采集后對(duì)誤差進(jìn)行修正。
通過(guò)以上校準(zhǔn)方法，可以確保激光共聚焦顯微鏡在成像過(guò)程中提供高質(zhì)量、高分辨率的圖像。
https://lifescience.evidentscientific.com.cn/zh/landing/objectives/research/confocal/
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